在我們的細(xì)胞實驗中經(jīng)常會用到質(zhì)粒DNA,現(xiàn)在都用劑盒非常方便,而且菌體培養(yǎng)后,可以多管濃縮提取,提到的質(zhì)粒量多,可以-20℃保存,以后用于酶切、轉(zhuǎn)化等實驗,可以提前跑個膠,只要不降解,就可以繼續(xù)用,避免每次要用,都要培養(yǎng)一遍再提取一遍。
質(zhì)粒DNA的提取
質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子,是獨立于細(xì)菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進行分子生物學(xué)實驗操作,進行遺傳工程改良物種等工作時MAX主要的DNA載體。
實驗步驟
1.搖菌培養(yǎng)
1)將鑒定測序正確的克隆菌液涂在LB固體平板。
2)置于37℃恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)12-17h,待長出菌落。
3) 滅菌15ml離心管內(nèi)加入5ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基,編號標(biāo)記。
4) 挑取單克隆菌團放置液體培養(yǎng)基,每個培養(yǎng)基放置1個菌落。
5) 37℃,180rpm,振蕩培養(yǎng)過夜。
2.收獲細(xì)菌并裂解
1) 離心擴增好的菌液,按說明書將菌液重懸,轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中。
2)用質(zhì)粒小量抽提試劑盒,按說明書要求提取質(zhì)粒。
3) 細(xì)菌高速離心1min,*去除上清。
4)加入250ulRB溶液,振蕩器充分懸浮細(xì)菌。
5)加入250ulLB溶液。立即上下顛倒10次,使細(xì)菌裂解,室溫,放置2min。
6)加入250ulNB溶液。立即上下顛倒10次,使之充分中和,室溫,放置2min。
7)室溫,1500rpm,高速離心15min。
8)將吸附柱放入收集管內(nèi),離心得到的上清轉(zhuǎn)移至吸附柱,室溫,15000rpm,高速離心30s。
9)棄廢液,將吸附柱放入收集管,加入700ul WB溶液到吸附柱中,15000rpm,高速離心30s。
10)重復(fù)上一操作。
11)將吸附柱放入干凈的1.5ml 離心管中,加30-50ul預(yù)熱的Elution Buffer,室溫,放置2min,高速離心1min。
12)樣品進行電泳檢測:1%瓊脂糖凝膠電泳,上樣量為2ul,紫外燈下觀察,MAX明亮的帶為超螺旋形式,可以在一定程度上表明提取質(zhì)粒的純度。
3.質(zhì)粒的純化
1)將之前提取好的質(zhì)粒放入1.5ml離心管中,加入1/10體積的3mol/L 無菌乙酸鈉溶液。
2)加入2倍體積的無水乙醇,放置于-20℃沉淀4-6h或過夜。
3)4℃,高速離心機14000rpm,離心20min.
4)棄去上清,70%乙醇洗2次。
5)空氣干燥,可置超凈工作臺干燥。
6)加200ul無菌水溶液干燥后所得沉淀,即為質(zhì)粒溶液。
7)紫外分光光度計測量質(zhì)粒濃度和產(chǎn)量。
測量OD260和OD280的值:質(zhì)粒DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數(shù)(μg/mL)。
10個常見問題
一.時間控制問題
裂解時間太長,加入溶液P2后裂解時間不應(yīng)超過5 分鐘;吸附時間不夠;溶解時間不夠都會導(dǎo)致質(zhì)粒DNA提取實驗失敗。
二.大腸桿菌老化
建議涂布平板培養(yǎng)后,重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)。
三.質(zhì)粒拷貝數(shù)低
由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA 提取量低,可更換具體相同功能的高拷貝數(shù)載體。
四.溶液使用不當(dāng)
溶液P2、P3 在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁,應(yīng)置于37℃培養(yǎng)箱保溫片刻直至溶解為清亮的溶液,才能使用。
五.吸附柱過載
不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的質(zhì)粒量很大,請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基,例如TB 或者 ×YT 菌液體積必須減少;若質(zhì)?;蛩拗骶欠浅8叩目截悢?shù)或生長率,則需調(diào)整LB 培養(yǎng)液體積。
六.質(zhì)粒未全部溶解
洗脫溶解質(zhì)粒時,可適當(dāng)加溫或延長溶解時間。
七.乙醇?xì)埩?/p>
漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體,樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂,再加入洗脫緩沖液。
八.洗脫液加入位置不正確
洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會*覆蓋硅膠膜的表面達到MAX大洗脫效率。
九.洗脫液不合適
DNA 只在低鹽溶液中才能被洗脫。洗脫效率取決于pH 值。MAX大洗脫效率在pH7.0~ 8.5 間。當(dāng)用水洗脫時確保其 pH 值在此范圍內(nèi),如果pH 過低可能性導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脫效率。
十.洗脫體積太小
洗脫體積對來回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高,但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
以上內(nèi)容僅供參考!
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